Cofinanciado pelo COMPETE 2020, este projeto visa combinar técnicas com análise/marcação combinatória para criar uma metodologia codificada por cores, permitindo assim uma detecção rápida, robusta e em multiplex de patogénicos e de genes resistentes a antibióticos.

 

 

 

Na última década os ensaios de hibridação in situ fluorescente (FISH) têm sido muito explorados para a identificação de agentes patogénicos clínicos. Vários estudos têm demonstrado que a sua implementação como um método de rotina em laboratórios clínicos permite o uso racional de medicamentos, reduz o tempo de internamento e a mortalidade. Outra vantagem importante é a capacidade de detetar resistências a antibióticos resultantes de mutações pontuais, que têm sido encontradas em bactérias que apresentam resistência a macrolidos e linezolida. 

 

Foram desenvolvidas duas novas variações de FISH (hibridação in situ fluorescente) para permitir:

 

> a detecção de vários alvos simultaneamente, ou 

 

> a detecção de genes de cópia única. 

 

A primeira (CLASI-FISH) tira partido da marcação fluorescente combinatória para criar um código de cor para cada característica; enquanto a segunda (RING-FISH) faz uso de sondas polirribonucleicas para permitir a detecção especifica de fragmentos do genoma bacteriano. No entanto, não existe qualquer técnica que combine estas diferentes vantagens. Além disso, estas técnicas de FISH sofrem de limitações associadas ao uso de sondas de DNA, tais como a baixa afinidade e longos passos de hibridação, que geralmente comprometem a robustez do processo e impedem uma aplicação mais ampla. A adaptação destas tecnologias aos novos mímicos de ácidos nucleicos, que têm uma maior afinidade para o alvo, pode ser realizada de forma a criar um processo mais rápido, robusto e simples.

 Dado o elevado potencial das técnicas de FISH recém-desenvolvidas e as propriedades de hibridização dos novos mímicos, o projeto Coded-FISH visa combinar várias estratégias para desenvolver uma nova metodologia FISH codificada por cores, que vai permitir uma detecção rápida, robusta e em multiplex (detecção de vários alvos simultaneamente) de genes de resistência de cópia única. 

 

Como caso de estudo serão selecionadas duas espécies resistentes, muito comuns e problemáticas - Enterobacteriaceae resistentes a carbapenem e Staphylococcus aureus resistente à meticilina. Como as propriedades dos agentes patogénicos são muito diversas, a primeira tarefa destina-se a prever as propriedades de hibridação para os diferentes mímicos, a fim de estabelecer as moléculas mais adequadas a cada situação. Uma vez alcançado este objetivo, será feito o desenho das moléculas para os agentes e resistências selecionadas. 

 

Em seguida, o método FISH será otimizado para a detecção de fenótipos de resistência e, nesta fase, a marcação combinatória das sondas será usada para aumentar o número de genes/agentes distinguíveis. 

 

Finalmente, a eficiência do método desenvolvido será testada em amostras de ambiente clínico e comparada com a aplicação de técnicas de cultura convencionais. O desenvolvimento de um método de FISH codificados por cor, com base nos novos mímicos de ácido nucleico é um aspeto inovador chave do projeto, não existindo qualquer aplicação molecular que permita a identificação e caracterização de vários agentes patogénicos simultaneamente. Além disso, esta é a primeira vez que a fusão entre mímicos, marcação combinatória e reconhecimento de genes de cópia única, é sugerida, tornando este um projeto muito inovador e desafiante.

 

 

A equipa deste projeto inclui investigadores juniores e seniores, todos com excelentes conhecimentos nas respetivas áreas de especialização. O PI já desenvolveu e patenteou vários métodos rápidos para a detecção de patógenios e contará com a colaboração de Nuno Azevedo, que recentemente expandiu os seus interesses de investigação para novos mímicos; Gary Borisy, especialista internacional em análise de imagem espectral e combinatória; e Jorge Pedrosa, que garante o conhecimento clínico para a validação final.

 

 

 

O projeto “Coded-FISH: Desenvolvimento de um novo método de RING FISH codificado por cores: uma ferramenta inovadora para a detecção de patogénios resistentes a antibióticos” conta com o apoio do COMPETE 2020 no âmbito do SAICT - Sistema de Apoio à Investigação Científica e Tecnológica, envolvendo um investimento elegível de cerca de 179 mil euros, o que resultou num incentivo FEDER de cerca de 152 mil euros.

 

 

 

Ficha do projeto https://www.ceb.uminho.pt/biofilm/Projects/Details/1584

Website Universidade do Minho https://www.uminho.pt/PT

Website Universidade do Porto www.up.pt/